DNA提取
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论 著
线粒体DNA提取方法的比较3
李伟文 陆松敏 刘建仓 武 凡 李 萍 柏干荣
第三军医大学野战外科研究所(重庆,400042)
摘要 目的将提取线粒体DNA的碱变性法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线Triton法、粒体DNA的方法。方法分离Wistar大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase8亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA。结果改进高盐沉淀法线粒体DNA量最多,Triton法最少。OD260 ～1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于OD280均在1.78结论改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,PCR扩增,测定出了线粒体DNAATPase8亚基基因序列。产量多的优点,该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序。
关键词 线粒体;DNA;分子遗传学
1981年,Anderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA(mtDNA),进行了全序列分析。此后,mtDNA的研究日益得到重视。本实验将Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较,发现后者具有简便、经济、易重复等优点。1 材料和方法111112 细胞分离
大鼠颈椎脱臼处死,30cm。先用37,注入0.25%枸盐酸结扎两端,置于,恒温摇床50r
弃内容液,分为8段,每段加含0.02%,in。
.37℃恒温摇床100r EDTA生理盐水2mlmin,35min,轻轻挤压一遍,100r 收集肠内min,5min。
琼脂糖系Promega产品,其它生化试剂系国产分析纯。
①溶液 :含Tris2HCl10mmol L,NaCl10mmol L,MgCl25mmol LpH7.5;
容液,加入约12ml生理盐水,2500r min,10min,
弃上清,沉淀再加入生理盐水,2500r min,5min.重复洗涤一次.计数后进行mtDNA提取。113 mtDNA提取及纯化
1.3.1Triton法[1] 取107细胞沉淀,悬浮于5ml
②溶液 :Tris2HCl10mmol L,NaCl400
mmol L,EDTA2mmol LpH8.0;
③溶液A:含50mmol L葡萄糖,25mmol LTris2HCl30mmol LEDTANa2,pH8.0;
的Triton溶解液中。温和振荡片刻后,室温下放置10min。反应完毕的溶液以8000r min离心1min,
上清即为mtDNA。
1.3.2碱变性法[2] 取107细胞沉淀,依次加入溶
④溶液B:0.2mol LNaOH含1%SDS(临用前用5mol LNaOH和10%SDS贮存液配制);
⑤溶液C:3mol L醋酸钾溶液,pH5.4,含5mol L醋酸根离子;
液A(4℃)150Λl,冰浴中将沉淀吹打分散后加入
300Λl溶液B(常温),将Eppendrof管缓慢颠倒10次,冰浴裂解变性6～8min,再加入225Λl溶液C(0～4℃),轻柔混匀,冰浴复性20～25min。反应完毕的溶液以10000r min离心6min,4℃,取上清。1.3.3改进高盐沉淀法[3] 取107细胞沉淀,加入溶
⑥Triton溶解液:含10mmol LKCl,15mmol LTris2HCl,pH8.3, 2.5mmol LMgCl2,1%V VTritonX2100;
⑦ΚDNA 7233、6770、BamH Marker16841、
6527、5256 5505bp;⑧BD2000Marker3000,2000,1000,750,500,200bp。
3
液 5500Λl,混匀,2000r 沉min,10min,弃上清。淀加溶液 5500Λl,混匀,3500r min,10min,弃上清。沉淀加溶液 950Λl,混匀后加入20mg ml蛋白酶K50Λl和10%SDS120Λl,快速混匀。40℃过夜或50℃4h。加入300Λl饱和醋酸钠,混匀,轻摇15S。15000r min,4℃,15min,取上清于
国家“九七三”项目资金资助(G1999054202)
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192 取上清后步骤相同。上清中加入等Eppendrof管中。
体积酚∶氯仿∶异醇(25∶24∶1),温和振荡8min,10000r min,10min4℃,取上层水相重复该
;扩增长度GGGAACATAATAATGGTCAC23′
248bp。扩增PCR标准反应体系在0.5mlEppendrof管中进行,反应总体积为50Λl。加入10
×buffer5Λl,MgCl2(25mmol L)3.6Λl,4×
1B(0.5Λl dNTP3.6Λl,引物1A Λg)各1.4Λl,模板(0.03Λg Λl)10Λl,PCR用水27Λl,石蜡油23Λl,95℃预变性220s,加入TaqDNA聚合酶0.9
过程抽提一次,轻取上层水相。加入2倍体积冰乙醇
或等体积异丙醇,冰浴30min,15000r min,10min,弃上清。用70%冰乙醇漂洗沉淀,15000r min,2min,彻底去上清。沉淀于空气中自然部分干
燥25min,加入适量RTE液溶解。贮于4℃。114 mtDNA样品鉴定
1.4.1紫外分光光度法测定 样品经适当稀释,用BECKMANDU7500紫外分光光度计定量。1.4.2琼脂糖凝胶电泳 电泳用DYY2 2型电泳
Λl。循环条件,95℃变性40S,55℃退火30S,72℃延伸36S,反应30个循环,最后72℃延伸10min.用DYY2 2型电泳仪,2%琼脂糖凝胶,取4Λl溶液与1ΛL上样液混和后点样,与BD2000Marker比较,100V4min,55V35min后紫外灯下观察、拍照,并
仪,0.7%琼脂糖凝胶,取6Λl溶解液与2Λl上样液
混匀后点样,与ΚDNA BamH Marker比较,100V4min,50V60min,紫外灯下观察并拍照。1.4.3聚合酶链反应(PCR)检测 以改进高盐沉淀法所提取mtDNA样品作为模板,测定线粒体DNAATPase8亚基基因序列。2个引物由上海博亚生物工程公司设计,1A:5′2
;1B:ACAATGACATGCCACAAC23′
进行DNA序列测定。2 结果
211 mtDNA的紫外吸收光谱分析
mtDNA样品浓度在0.3～1.3Λg Λl之间。
～.,改进高盐沉淀OD260 280在1.78,Triton法
1)θ±s,n=8)表量的比较(x
Triton法
mtDNA量()
0.21±0.02
碱变性法
0.30±0.023
高盐沉淀法
13.29±0.8833
注:3P<0.05(碱变性法与Triton法比较),
33P<0.01(高盐沉淀法与Triton法比较); P<0.01(高盐沉淀法与碱变性法比较)
212 mtDNA琼脂糖凝胶电泳分析
3种方法所提取mtDNA样品电泳后,均可见
16.3kb的单一mtDNA条带(图1)。改进高盐沉淀
法提取mtDNA电泳条带最亮,Triton法的最弱。
图1 3种方法提取mtDNA琼脂糖凝胶电泳图 图2 ATPase8基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳 A、E泳道为ΚDNA BamHIMarkers, A、B泳道分别为BD2000Marker,248bp产物 B、碱变性法、C、D泳道分别为高盐沉淀法、 Triton法提取ntDNA。
213 PCR产物分析
扩增产物图谱为248bp左右片段(图2)。送上海博亚生物工程公司测序,将测序结果经计算机GenBank查询,发现与Wistar大鼠mtDNAATPase8亚基基因同源性在99%,确定为线粒体基因,位置为7735～7983。
3 讨论
自Anderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒
体DNA后,有人参考Tamura和Palva提取动物组织mtDNA的方法,结合碱变性法提20kb以下质粒DNA原理,提取了人肝组织中mtDNA。胡义德
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对该方法进行了改进。戴纪刚建立通过核质分离,即利用非离子型去污剂Triton2100能溶解核被膜以外的所有细胞膜的特点[4],分离细胞核 细胞质,来获取mtDNA。而高盐沉淀法通过SDS(十二烷基硫酸钠)破坏细胞膜、核膜,使蛋白质变性,从而游离出来核酸。蛋EDTA能抑制细胞中DNA酶的活性。白酶K进一步将蛋白质降解成小肽。加入饱和乙酸钠后,绝大部分线性大分子量DNA和蛋白质在SDS作用下变性形成沉淀,而环状mtDNA仍为自然状态,通过高速离心,除去绝大部分细胞碎片、染色体DNA及蛋白质,mtDNA仍在上清中。
上述方法都用酚 氯仿 异戊醇抽提蛋白质、乙醇沉淀核酸。但均优缺点并存。虽然碱变性法操作时间较短,但该类方法要求条件比较严格,不易重复。使用Triton2100将核质分离制备mtDNA法操
作时间短,但产量低,易降解。而高盐沉淀法操作简单,易重复,可依需用量扩大反应体系,使mtDNA质量得以轻松控制。因此,该法具有其它方法无法比拟的优点。
参
考
文
献
1 胡义德.人白细胞线粒体DNA的快速分离与鉴定.中
华血液学杂志,1997;18(11):605
2 戴纪刚.一种简单快速制备动物线粒体DNA的方法.
第三军医大学学报,2000;22(4):391
3 伍新尧.分子遗传与基因工程,河南医科大学出版社.
郑州,1997:p37
4 HymerWCetal.Isolationofnucleifrommammalian
tissuesthroughtheuseofTritonX2100.JHistolChemCytochem,1994:312(12):359
(2002206214 收稿)
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